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Le parcours 2016 est très proche de celui de 2015. Le départ sera donné à Neuilly-sur-Marne, à 18h30 le mercredi 1er Juin, pour un premier tronçon de 14,6km jusqu'à Saint-Thibault-des-Vignes, dans le parc où se déroulent les 24 heures.
Les concurrentes rejoindront Charly-sur-Marne où le départ pour Château-Thierry sera donné à 22h15. Les concurrents,quant à eux, se rendront directement à Château-Thierry où le départ sera donné en direction d'Epinal à partir de 22h30. Cette étape leur permettra de traverser quelques villes qui ont fait la renommée de l'épreuve : Epernay, Châlons-en-Champagne, Vitry-le-François, Bar-le-Duc où aura lieu le repos obligatoire de 2 heures.
Les concurrentes repartiront de la place d'Armes de Vitry-le-François, le jeudi à partir de 16h00, en direction d'Epinal qu'elles atteindront sans devoir s'arrêter à Neufchâteau.
Le samedi matin, le départ sera donné à Plainfaing,à partir de 9h00, en direction de Ribeauvillé, en suivant le même itinéraire qu'en 2015.